本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法。所述方法包括用来源于阿非利加棉BAC文库的BAC克隆57123在不同棉种中进行BAC-FISH的步骤，可同时明显分辨棉花AD基因组及A、D亚基因组染色体。以该BAC-DNA做探针，杂交信号在棉属5个四倍体中覆盖A亚组全部染色体端部以外的大部分区域，及D亚组全部染色体近中部小部分区域；在陆地棉与E组司笃克氏棉(E1)杂交的异源六倍体杂种AADDEE中，杂交信号与四倍体类似，明显与E亚组(无信号)区分开来，即实现了A、D、E三套亚组染色体的同时鉴别。利用本发明的BAC克隆采用BAC-FISH方法，可以在棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体。